Sequenziamento Sanger

Il sequenziamento Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA che presenta come obiettivo quello di ottenere la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA.
Si procede preparando una miscela di reazione contenente:

  1. il frammento di DNA da sequenziare (DNA stampo), denaturato quindi a singolo filamento, presente in più copie prodotto a PCR;
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  2. un primer, ossia una breve sequenza oligonucleotidica unica e complementare alla regione a monte di quella che si vuole ottenere;
  3. una DNA polimerasi termostabile (dunque una Taq polimerasi);
  4. i quattro deossinucleotidi (dNTP)
  5. un dideossinucleotide (ddNTP) marcato radioattivamente o con fluorescenza in modo da poter visualizzare le bande dei frammenti di DNA neosintetizzato in seguito alla corsa per elettroforesi;

I dNTP e i ddNTP sono in competizione tra loro per l'incorporazione all'interno della catena in crescita, questo perché la Taq polimerasi non riesce a discriminarli.
I ddNTP sono analoghi dei deossinucleotidi, ma mancano del gruppo ossidrile all'estremità 3', dunque una volta incorporati nella catena ne bloccano l'accrescimento. La terminazione della catena avviene casualmente, a seconda di quando viene incorporato il ddNTP.
La miscela viene suddivisa in quattro diverse frazione (A, T, G, C) a ciascuna delle quali si aggiunge un diverso ddNTP e si incubano per un tempo opportuno. Poiché l'incorporazione del ddNTP avviene in maniera totalmente casuale, durante l'incubazione si formeranno in ciascuna frazione frammenti polinucleotidici di lunghezza differente, tutti terminanti col ddNTP presente in quella frazione.
In seguito all'incubazione le quattro frazioni vengono denaturate al calore, per separare le catene nucleotidiche appaiate, e sottoposte a elettroforesi in un unico gel.
Le diverse catene polinucleotidiche neosintetizzate migreranno nel gel verso l'anodo in funzione della loro lunghezza e possono essere facilmente localizzate data la marcatura dei ddNTP.
I frammenti di DNA marcati, colpiti da una sorgente luminosa (laser ad Argon) emettono una fluorescenza che viene rilevata, man mano che si spostano lungo il gel elettroforetico, da un sensore. La fluorescenza rilevata dal sensore proviene da quattro differenti colori ognuno associato ad una base nucleotidica. La rappresentazione dei dati rilevati viene effettuata mediante un elettroferogramma. In esso ogni picco rappresenta una base letta durante il passaggio nel capillare in base alla remissione dei fotoni di DNA in seguito alla sollecitazione con laser.
Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni in unico tubo da saggio e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel.

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