PCR

Chiamata anche reazione a catena della polimerasi, il suo fine è quello di amplificare un segmento di DNA in vitro permettendo di analizzare l'informazione genetica contenuta nel patrimonio genetico di un individuo. Si basa sul principio della replicazione del DNA grazie all'utilizzo della DNA polimerasi.

COSA MI SERVE PER LA PCR?

  • DNA stampo, segmento di DNA a doppio filamento da voler amplificare;
  • Primers, oligonucleotidi complementari alle sequenze fiancheggianti;
  • Desossiribonucleotidi trifosfato (nucleotidi trifosfato)
  • Tampone contenete cloruro di magnesio, che serve per far funzionare meglio la DNA polimerasi;
  • Enzima, tradizionalmente viene utilizzata la TAQ polimerasi.

DNA TARGET
E' la sequenza da amplificare contenuta tra due sequenze definite sequenze fiancheggianti, complementari al primer che funge da sito di attacco per la DNA polimerasi.

TAQ POLIMERASI
E' un enzima termostabile estratto dal batterio Termophilus Aquaticus, che vive ad alte temperature circa 75°C. La PCR lavora a circa 45°C e quindi la TAQ polimerasi viene utilizzata perchè è l'unico enzima a non denaturarsi a queste temperature.

TECNICA
Tutti gli elementi necessari per la PCR vengono posti in provetta, ho quindi bisogno di un termociclatore, dove riporrle e riscaldarle.

Il procedimeto si divide in tre fasi che vengono ripetute in cicli successivi:

  • DENATURAZIONE, il DNA viene denaturato a circa 90°C in modo da permettere la rottura dei legami a idrogeno tra le basi azotate e creare due filamenti singoli;
  • ANNEALING (o fase di appaiamento dei primer), viene abbassata la temperatura in base al primer utilizzato per permettere il loro appaiamento alle sequenze fiancheggianti complementari;
  • ALLUNGAMENTO, viene rialzata leggermente la temperatura a circa 70°C per far sì che la TAQ polimerasi inizi la sintesi del DNA target.

Alla fine ho un'amplificazione esponenziale del DNA target, in pochissimo tempo.

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